生物透射电镜(生物TEM)

项目简介

　　生物透射电镜是观察生物细胞样品内部形态的重要工具，其电压在80-120kv可以降低生物样品因高能电子束辐射而损伤的影响，同时依赖于生物样品制备技术的发展，如超薄切片技术、负染色技术、冷冻制样技术、细胞化学技术等，广泛应用于组织学、细胞学、病毒学、病理学及材料学等多个学科的研究中，一般用来观察细胞整体结构、细胞膜细胞壁细胞器的变化、材料进入细胞内部的分布情况或者细胞应付外界刺激产生的自噬小体等结构，以及外界生物入侵的侵染结构等等。

常见项目

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结果展示

　　生物样品透射电镜取材注意事项

　　取材是电镜实验的第一步，其操作成功与否直接关系到电镜结果的效果及成败。为了得到好的结果，请务必按要求做好取材!取材基本要点：快(1min)、冷(4℃)、小(1 mm3)、净(无杂质)、准(部位准确)。不同的样品，取材细节上有很大区别!

　　(一)动物组织取材流程及要求

　　取材流程：动物麻醉或断头急性处死，解剖取出所需的器官或组织，生理盐水简单冲洗血液及组织液。按要求将组织切成1mm³左右小块，固定于组织及细胞电镜专用2.5%戊二醛固定液。

　　

　　取材要求：

　　(1)位置：肝、肺、脾等无需定位组织取1mm³组织，3-5块;需要定位组织如骨骼肌、肾、肠、血管、胰岛等组织取材大小为0.5mm×1mm×3mm左右的长条状，且保证观察结构在组织块中。

　　(2)操作：试剂、容器、器械提前4℃预冷;组织离体后，1min内浸入戊二醛固定液。取材时，可提前准备一个载玻片(硬卡纸)，滴几滴戊二醛固定液，把标本浸在液滴中修整至合适大小(时间可稍长)，用牙签挑出3～5粒标本，放入1.5ml尖头EP管。将修整好的标本块放入戊二醛固定液后，普通4℃冰箱保存。

　　(二)细胞取材流程及要求

　　取材流程：细胞直接刮下(不可胰酶消化，会造成细胞损伤)，细胞悬液离心，弃上清，PBS洗2次(敏感的细胞直接固定，不洗)，低速(1000-3000rpm)离心成团，加入组织及细胞电镜专用2.5%戊二醛固定液4℃过夜后快递。悬浮细胞、菌液可直接视为细胞悬浮液操作。固体培养基培养的菌可直接将菌落挑到PBS中，后续操作一致。

　　

　　取材要求：

　　(1)细胞数量充足(6cm或10cm皿长满)，离心后在EP管中黄豆大小;

　　(2)缓冲液、戊二醛固定液等PH值7.3-7.4，4℃提前预冷;

　　(3)贴壁细胞连着培养基用细胞刮斜着快速刮下，不要反复来回刮;

　　(4)细胞悬液转入离心管，1000-3000rpm离心成团，弃上清，加PBS，将细胞转入1.5mL尖头EP管，再次离心后弃上清。再加PBS重复上述步骤，最后加2.5%戊二醛固定，4℃保存。操作轻柔，尽量保证细胞不散开。(转速及时间请结合细胞情况，尽量低转速、短时间，以细胞离心成团为准!(PBS 清洗时间过长，易造成细胞损伤);

　　(三)植物组织取材及要求

　　取材流程：PBS冲洗样品，确保无泥沙等污染物。然后用锋利刀片或剪刀将样品切成合适大小，装入预冷的植物及细菌电镜专用2.5%戊二醛中。不需要定位的样品切成1立方毫米大小(如叶片、果实、花粉等)，需要定位的样品，切成0.5mm×1mm×3mm的长条状(茎、根、表皮等)随后抽气，让组织能沉淀到管底。(简易抽气方法：将植物组织同固定液一起倒入注射器，用乳胶手套食指堵住注射器出口，右手拉动针栓，将注射器口垂直向上，松开食指，右手轻推针栓使液面上的气泡从注射器口排出，反复多次，直至组织沉入固定液。)

　　

　　(四)其他样品

　　悬浮细胞、细菌可视为细胞悬液操作。固体培养的细菌，可视为被切小的组织块，直接用牙签挑取3-5个菌落即可。外泌体、纳米材料、脂质体、病毒颗粒等负染样品，不需要固定，新鲜样本保持低温运送。

　　(五)样本储存运输标准：

　　储存：样本取材后，4℃保存时间不超过1个月。

　　运输：固定液充满EP管，封口膜封口，气泡膜或报纸包裹厚一些。最后泡沫盒+冰袋的方式运输，冰袋2-3个(-20℃冰袋，不要太多)，一定要与样品隔开。特殊样品如脂肪、植物等用纱布将样品压到液面以下，保证充分固定。(见下图)

　　

　　参考图：

　　

常见问题

　　常见问题

　　1.植物的根部为什么有时看不到细胞核?

　　植物细胞的细胞核相对比较小，不好切，切片的时候有可能没有切到，所以在观察透射电镜的时候会发现看不到细胞核。

　　2.切片染色的目的是什么?

　　由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。

　　为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐(如铅盐、铀盐等)与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。

　　3.2.5%戊二醛固定液如何配置?

　　市售25%戊二醛水溶液         10ml

　　0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)     50ml

　　蒸馏水加至                  100ml

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